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共焦点顕微鏡の原理 | MEMS共焦点ユニット

共焦点顕微鏡の原理

はじめに

共焦点顕微鏡で得られる画像

共焦点(コンフォーカル)顕微鏡とは、簡単に言えば、観察したい焦点面以外で発生した蛍光を取り除いた画像を取得できる顕微鏡です。結果として、ボケが少なく高コントラストで解像度の良い画像が得られます。一枚一枚の画像が正確に特定の焦点面に位置する蛍光試料を映しているため、焦点面位置を連続的に変えた画像を複数取得して三次元画像を構築することもよく行われます。この様な画像から試料の立体的な位置関係を正確に知ることが出来ます。

図1:共焦点顕微鏡画像と通常の全視野顕微鏡画像との比較例

図2:共焦点顕微鏡で取得した三次元画像例

どの様にして焦点面以外からの光を取り除くのか、共焦点顕微鏡の原理をわかりやすく説明します。

通常の顕微鏡と何が違うか

励起光の軌跡と蛍光発生

蛍光計測を行うためには必ず励起光を試料にあてる必要があります。この励起光がどの様な経路をたどり、どこで蛍光を発生させるかを順に追いながら共焦点顕微鏡の原理を説明します。
共焦点顕微鏡では、通常励起光源にレーザ光を用います。レーザ光は点光源で直進性も良いため、対物レンズを通して焦点面に集光され光スポット※1を形成します。通常の全視野蛍光顕微鏡では試料全面を一度に励起するのに対して、共焦点顕微鏡では一度に焦点面上の一点のみを励起します。

※1:光スポットがどれほど小さい点に集光できるかは対物レンズNAと波長によって決まります。高NAであるほど、短波長であるほどスポットサイズは小さくなり分解能も上がります。

図3:レーザ光の焦点面への集光の概念図

通常空気中を通る光の経路をそのまま観察することは出来ません。その為対物レンズの上に蛍光体のブロックを配置しました。対物レンズから発せられた励起光が蛍光体の中を通ることで、その経路にある蛍光体が蛍光を四方に発します。その蛍光を観察することで励起光の経路をたどることが出来ます。
図4ではレーザ光が焦点面でスポットを形成しているのに対して、通常の全視野顕微鏡の励起光は試料全面を励起するため広がりを持ったままであることが分かります。

図4:レーザ励起光と通常の全視野顕微鏡励起光との比較画像

上述の様にレーザ光は焦点面のある一点に集光しスポットを形成します。しかしz(光の進行)方向で考えれば、レーザ光は対物レンズによって収束・発散しその過程に応じた広がりを持ちます。当然ながら焦点面の上下位置を含めてレーザ光が伝播し、そこに蛍光物質があれば蛍光を発します。図5において、蛍光体ブロック内で、焦点面の上下でも蛍光が発せられていることが分かります。

 

実際の実験試料でもこの焦点面外での蛍光は発生し、画像のボケ成分の原因となります。共焦点顕微鏡では、この焦点面外で発せられた蛍光を受光時点で取り除きます。その為焦点面以外の光の影響を受けずに焦点面からの光のみで画像を作ることが可能になります。

図5:焦点面へのレーザ光の収束と焦点面からの発散の様子

共焦点光学系の要

ピンホールによる焦点面外光の除去

では焦点面外からの蛍光をどの様に取り除くのでしょうか。焦点面と、その上下位置で発生した蛍光が検出器に向けてどの様な経路をたどるかを追って共焦点の原理を説明します。

図6:焦点面から発した蛍光の受光の概念図

対物レンズ焦点面で発生した蛍光は、対物レンズから結像レンズを通り、検出器の前で焦点を結びます。この位置にピンホールを設置します。

 

この時、サンプル上にある焦点面とピンホール、そして光源が共役の位置関係にあります。
共役な位置関係では、どちらかの一方から発した光が他方で一点に集光します。
検出器はこのピンホールを通り抜けた光を検出します。
この様に共役な位置関係にあるピンホールを介して信号を受光する光学系を、共焦点光学系と呼びます。

それでは共焦点光学系では、焦点から外れた場所から発せられた蛍光はどの様な経路をたどるのでしょうか。

図7:焦点面外から発した蛍光の除外の概念図

図7左の赤い丸で示した様な焦点より上で発せられた蛍光は、ピンホールより上部で焦点を結び、ピンホール部分では光が広がるため大部分が遮光され検出器へは光が届きません。

次に、青い丸で示した様な焦点面より下で発せられた蛍光は、ピンホールより下部で焦点を結ぶため、同様にピンホール部分では集光せずに大部分が遮光されます。※2
この様にして焦点面から発せされた蛍光だけを検出器に導くことが出来ます。

※2:試料上の光スポットサイズが対物レンズによって異なる様に、ピンホール位置における蛍光スポットサイズも対物レンズによって異なります。共焦点顕微鏡では通常ピンホールサイズを対物レンズに合わせて調節します。弊社共焦点ユニットMAICOではS、M、Lの三種類のピンホールサイズを対物レンズに合わせて選択できる様になっています。

励起光は光路上の何処でも蛍光物質があれば蛍光を発生させますが、受光側ピンホールで共役位置から発せられた蛍光のみを選別することで、結果として焦点位置のみに由来する像を得ることが出来ます。これを光学切片像と呼びます。共焦点顕微鏡の最大の特長は、厚みのある試料からこの光学切片像を得られることです。

二次元の画像を得る光走査

ここまでの説明では励起光スポットの位置が一点で固定されていましたが、実際には光走査素子で光スポットを2次元方向に動かして一枚の共焦点蛍光画像を作成します。弊社共焦点ユニットMAICOではこの光走査にMEMSミラーを用いています。※3図8では、光路上にあるMEMSミラーが角度を変えている様子と、それに伴い試料上の励起光スポットが横方向に移動している様子を示しています。図9では試料平面を順次光走査している様子を模式的に示しています。

※3 MEMSミラーについては「特長」ページを御覧ください。

励起光スポットを走査させる事は、通常の全視野励起と比較してスポット光周辺の隣接した蛍光分子を励起させず、横方向からの迷光を発生させにくいメリットも持ちます。

図8:MEMSミラーの動きと励起光スポット移動の概念図
* 実際の画像取得時動作とは異なります。

図9:励起光スポットによる焦点面の平面走査の概念図

PMT信号と画像の形成

光検出器であるPMT(光電子増倍管)は受光面に入射された蛍光量に応じた電気信号を経時的に出力しますが、位置情報を持ちません。
一方で光走査素子はxy方向に決められた位置を、決められた時間で走査します。
PMTが出力する信号が、どの時間においてどの場所に由来する信号であるのかを再構成して画像化を行います。言い換えれば信号強度の時間情報を空間情報に変換して、画像のxy座標に輝度情報を割り当て画像を生成します。

図10:PMTの経時的な信号出力から2D画像への変換例

三次元画像の計測方法

冒頭に述べた様に、共焦点計測で得られる光学切片像は特定の焦点面に位置する試料を映しているため、三次元画像を構築する事もよく行われます。 三次元画像を得るためには、励起光が試料上で焦点を結ぶ位置を上下させ、複数の焦点面からの共焦点画像を順次取得します。対物レンズ焦点面はレンズ先端から固定距離にあります。その為、三次元計測を行うには一般的に対物レンズ、あるいは試料を載せたステージを電動で制御し、試料と対物レンズの相対的な距離を定められた間隔で変位させる必要があります。

図11:対物レンズ上下移動に伴う光スポットの移動と、得られる画像の変化

図11では対物レンズを上下に動かすことで試料上に結ばれる焦点位置も上下に動くこと、そして焦点が上下することで共焦点画像として取得される位置も変化することを画像例で示しています。図11の右側で得られた各々の高さ位置由来の個別の共焦点画像を立体再構築する事で図2の三次元画像を作成することが出来ます。

※図11左の画像では励起光スポットを走査していませんが、実際の計測では走査素子にてxy平面を走査しつつ、順次焦点位置を上下させます。

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