共焦点(コンフォーカル)顕微鏡とは、観察したい焦点面以外で発生した蛍光を取り除いた画像を取得できる顕微鏡です。そのため、ボケが少なく高コントラストで解像度の高い画像が得られます。一枚一枚の画像が正確に特定の焦点面に位置する蛍光試料を映しているため、焦点面位置を連続的に変えた画像を複数取得し、3次元画像を構築することも可能です。この様な画像から試料の立体的な位置関係を正確に知ることができます。
共焦点顕微鏡の一番の特長は、検出器の前にピンホールを配置していることです。このピンホールを焦点と共役の位置に配置することで、焦点から外れたところで発生した蛍光をピンホールによって遮光することができ、ボケの原因となる光を取り除くことができます。(図2)
共焦点顕微鏡の方式には大きくポイントスキャン型とニポウディスク型(スピニングディスク型)の2種類があります。以降ではそれぞれの特長について説明します。
図1 : 共焦点顕微鏡と通常の落射照明顕微鏡との画像比較
図2 : 共焦点顕微鏡の光学系模式図
ポイントスキャン型の共焦点顕微鏡は、主にガルバノミラーと呼ばれるミラーを使用し2次元方向にレーザを走査することで画像を取得します。ガルバノミラーを使用したスキャナはガルバノスキャナと呼ばれます。
ガルバノスキャナの他にレゾナントスキャナ(一定の速度で共振するミラーを使用したスキャナ)を使用する方式もあります。レゾナントスキャナは一般的にガルバノスキャナよりも高速に走査が可能なため、高速な撮影を実現します。ただし、レゾナントスキャナは一定の速度で一定の振れ角を共振しているため、視野範囲を変えたり、特定の部分のみレーザを照射するといったフレキシブルな走査ができない点がデメリットです。
レゾナントスキャナはガルバノスキャナよりも高速なため、1ポイントあたりにレーザが照射される時間が短くなり、蛍光の強度が弱くなります。ガルバノスキャナと同等の蛍光強度を得たい場合、レーザの強度を上げるか、多重スキャンを行うことでこれを達成できます。蛍光分子は、強い励起光を1度当てられるよりも、弱い励起光で何度も励起されるほうが褪色が起こりにくいということが分かっています。そのため、ガルバノスキャナとレゾナントスキャナで同じ時間イメージングを行った場合、レゾナントスキャナのほうが褪色が起こりにくいというメリットがあります。
ポイントスキャン型の共焦点顕微鏡の検出器には主にPMT(光電子増倍管)やSiPM(Silicon Photomultiplier)が使用されます。
図3:ポイントスキャン型共焦点顕微鏡の模式図
ニポウディスク型の共焦点顕微鏡は、ニポウディスクと呼ばれる無数の穴が開いたディスクを回転させることで画像を取得します。ポイントスキャン型の共焦点顕微鏡では、1点ずつレーザを照射しミラーなどでスキャンをする時間がかかるのに対し、ニポウディスク型の共焦点顕微鏡ではディスクの回転により、多点で同時にスキャンを行うため高速に撮影を行うことができます。
検出には主にCMOSカメラを使用するため、カメラの感度やノイズ性能が画像のS/Nに大きく影響します。
ニポウディスク型の共焦点顕微鏡は、レゾナントスキャナの共焦点顕微鏡と同様に弱い励起光で多重スキャンを行うため、サンプルの褪色が抑えられるというメリットがある一方、ポイントスキャン型の共焦点顕微鏡と比較して感度が低い傾向にあります。
図4:ニポウディスク型共焦点顕微鏡の模式図
花粉の共焦点断層画像
共焦点高速カルシウムイメージング観察
ライブセル4波長Zセクショニング画像と3D再構築画像
心筋細胞の高速共焦点カルシウムイメージング
マウス脳のZセクションイメージング
MPPCを内蔵した極微弱光検出が可能なフォトンカウンティング・モジュールです。優れた増倍再現性により、生体深部の高コントラストな可視化に貢献します。
MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems)技術を応用した電磁駆動式のミラーです。低消費電力とともに、広い光学的振れ角、高いミラー反射率を実現しています。ポイントスキャン型共焦点顕微鏡用のミラーとして使用されます。
ORCA-Quest 2 qCMOSカメラは極めて優れた低ノイズ性能を持ち究極の定量イメージングを実現したカメラです。0.3 electrons rmsという極めて低い読み出しノイズにより光子数識別機能を実現しています。
可視から近赤外まで幅広い波長における蛍光観察に最適なCMOSカメラです。ニポウディスク型共焦点顕微鏡の検出器として使用されます。
倒立顕微鏡に取り付けるだけで、共焦点蛍光イメージングが可能になるユニットです。コンパクト且つ手の届く価格で共焦点蛍光イメージングができる環境を実現します。
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